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duplicate的三个问题：
一.什么是duplicate？
二.duplicate来源？
三.既然PCR将1个reads复制得到成百上千copies，那为什么二代数据duplicate rate 一般才10+%？
摘自罗俊峰博士，阅尔基因研发总监陈云地博士，阅尔基因CTO http://www.biotrainee.com/thread-1382-1-1.html
一、什么是Duplicated Reads
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谈到NGS数据的duplicated reads（暂且翻译为“重复数据”），我们通常会直观地认为：duplicated reads是在NGS文库构建过程中，由于PCR过度扩增导致同一个模板DNA片段被反复测序多次，得到一模一样的reads。
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但是这经不起推敲。仔细一想，就很困惑。
PCR不就是用来产生重复数据的吗？否则不叫PCR了。除了PCR-free的文库构建方法以外，大部分NGS文库构建方法都有PCR步骤，难道说这些NGS数据都有问题？
这是不可能的。或许：
PCR可以产生重复序列，但是不能额外多产生一条或多条。设一个基因组有A、B两个片段，PCR后，如果得到1000A+1000B，是正确的；如果得到1000A+1000A+1000B，多出来的1000A就是重复数据？问题是，PCR怎么会凭空多出来1000条片段A的测序reads呢？这要PCR出了什么样的问题，才能产生出这样的结果？
PCR是不会这样的。或许：
A+B经过PCR后得到1500A+1000B，多出来的500条A是重复数据？这不就是大家常说的PCR bias吗？
到底什么是“过度扩增”呢？
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严格的定义是这样的：
duplicated reads是PCR对同一个分子进行多次镜像复制的后果。
判断是否为镜像分子的标准是：reads的起始和终止位置一样，起点和终点之间的碱基序列一样（不妨简称为“三一样”）。只要起点、终点、或者起点与终点之间的序列三者之中有一个不同，就是不同的分子，称为unique reads。
镜像复制出来的分子个数与总分子数的比例就是duplication rate，duplication rate = 1 - unique reads / total reads。
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PCR本来就是用来镜像复制DNA片段的。对于最理想的NGS数据分析，难道要尽可能把所有通过PCR获得的子链的测序数据全部去除，要把PCR的效果完全消除，要还原到没有PCR的状态？
是的。
设一个基因组有A、B两个片段，PCR后得到无论多少条reads，比如n?A+m?B条，在数据分析的时候，都只保留1条A和1条B（unique reads）用于组装，而去掉(n-1)条A和(m-1)条B。共有(n-1)条A和(m-1)条B被当成duplicatedreads看待，尽管它们是正常PCR的正常产物。
所以，
目前的算法其实是一个简化的处理方案，把所有重复的reads都去掉了，留下完全不重复的reads。算法没有能力区分“假重复”（人为造成的重复序列方面的bias)和“真重复”（天然存在的重复序列）。
所以，
对于NGS 数据而言，Duplicateddata是一个生物信息学概念，不是分子生物学概念；是人为规定的，不是文库构建、高通量测序等生化反应自然生成的。
以下摘自 wangpeng905 链接：https://www.jianshu.com/p/1e6189f641db
要弄清楚这个问题，需要从 NGS 数据产出流程说起：
我们首先假设基因组核酸提取是完整的基因组，打断是完全随机的（通常是这样的）。
在第 3 步，PCR 扩增时同一个文库分子会产生多个相同的拷贝，这是 duplicate 的主要来源（PCR duplicate）。
第 4 步，文库中 DNA 片段与 flowcell 上引物结合，来源于同一个 DNA 片段的多个拷贝都结合到 flowcell 上，这样会导致生成多个相同的 cluster，测序时也就有多个相同的序列被测出来，这些相同的序列就是 duplicate。
同在第 4 步，生成 cluster 时候一个 cluster 中的 DNA 链可能搭到旁边另外一个 cluster 生成位点上，又长成一个相同的 cluster ，这也是 duplicate 的一个来源（Hiseq4000之后的 flowcell 会有的 cluster duplicate）。
第 5 步，一个 cluster 测序时的捕获的荧光亮点由于形状奇特，可能被软件当成两个荧光点来处理，这也产生了两条完全相同的 reads。这个过程中可能产生完全相同的 reads。（光学 duplicate）
由此我们知道，PCR duplicate 特点是随机分布于 flowcell 表面，光学 duplicate 特点是它们都来自 flowcell 上位置相邻的 cluster 。cluster 的位置被记录在 Fastq 文件 @seq-id 这一行中。
下图的右下角还有一种 duplicate 来源，sister? 这种一个文库分子的两条互补链同时都与 flowcell 上的引物结合分别形成了各自的 cluster，最后产生的两对 reads 完全反向互补，map 到参考基因组也分别在正负链上的相同位置，有的分析中也算 duplicate，虽然我遇到的这种正负链测序结果通常是不算 duplicate 的。
另外，据说 NextSeq 平台上出现过由于荧光信号捕获相机移动位置不够，导致 tile 边缘被重复拍摄，每次采样区域的边缘由于重复采样而出现的 duplicate，下图中蓝色点代表 duplicate ，在 tile 两侧明显富集。Illumina 公司回应说这没毛病，符合预期……
我曾经有这样的疑惑，为什么文库构建过程中的 PCR 将每个文库分子都扩增了上千倍，以 PCR 10个循环为例 2^10= 1024 ，但是实际测序数据中 duplication 率并不高（低于20%）。后来我看到一篇文章从统计概率的角度详细探讨了一下 duplication 率的影响因素，顺便一提，这个博主的故事也很令人佩服。
PCR 的过程中不同长度的文库分子被扩增的效率不同（GC 太高或 AT 含量太高都会影响扩增效率），PCR 更倾向于扩增短片段的文库分子，这里先不考虑文库片段扩增效率的差异，把问题简化一下，假设所有文库分子扩增效率都相同。PCR duplicate 的主要来源是同一个文库分子的不同拷贝都在 flowcell 上生成了可以被测序的 cluster ，导致同一个分子的序列被测序仪读取多次。那么为何在每个分子都有上千个拷贝的情况下，实际却很少出现同一分子的多个拷贝被测序的情况呢？主要原因就是文库中 unique 分子的数量比被 flowcell 上引物捕获的分子数量多很多，直白点说就是 flowcell 上用于捕获文库分子的引物数量太少了，两者不在同一个数量级，导致很少出现同一个文库分子的多个拷贝被 flowcell 上引物捕获生成 cluster。
假设文库中所有分子与引物的结合都是随机的，简化一下就相当于，一个箱子中有 n 种颜色的球（文库中的 n 种 unique 分子），每种颜色有 1000 个（PCR 扩增的，随 cycle 数变化），从这个箱子中随机拿出来 k 个球（最终测序得到 k 条 reads），其中出现相同颜色的球就是 duplicate，那么 duplication 率就可以根据有多少种颜色的球被取出 0,1,2,3…… 次的概率计算，可以近似用泊松分布模型来描述。
以人全基因组重测序 30X 为例，PE150 需要约 3x10^8条 reads ，文库中 unique 分子数其实可以通过上机文库的浓度和体积（外加 PCR 循环数）计算出来，这里用近似值 3.5x10^10 个 unique 分子。每个 unique 分子期望被测序的次数是 3x108/3.5x1010 = 0.0085 ，每个 unique 分子被测 0,1,2,3… 次的概率如下图：
> x <- seq(0,10,1)
> xnames <- as.character(x)
> xlab <- "一个文库分子的所有拷贝被测序的次数"
> ylab <- "概率"
> barplot(dpois(x,lambda = 0.0085),
+ names.arg = xnames,
+ xlab = xlab,
+ ylab = ylab)
由于 unique 分子数量太多，被测 0 次的概率远高于 1 和 2 次，我们去除 0 次的看一下：
> x <- seq(1,10,1)
> xnames <- as.character(x)
> xlab <- "一个文库分子的所有拷贝被测序的次数"
> ylab <- "概率"
> barplot(dpois(x,lambda = 0.0085),
+ names.arg = xnames,
+ xlab = xlab,
+ ylab = ylab)
unique 分子被测序 1 次的概率远大于 2次及以上，即便一个 unique 分子被测序 2 次，我们去除 duplicate 时候还会保留其中一条 reads。
如果降低文库中 unique 分子数量到 4.5x10^9 个，PCR 循环数增加以便浓度达到跟上面模拟的情况相同，测序 reads 数还是 3x10^8 条，每个 unique 分子预期被测序的次数是 3x108/4.5x109 = 0.067 。
> x <- seq(1,10,1)
> xnames <- as.character(x)
> xlab <- "一个文库分子的所有拷贝被测序的次数"
> ylab <- "概率"
> barplot(dpois(x,lambda = 0.067),
+ names.arg = xnames,
+ xlab = xlab,
+ ylab = ylab)
unique 分子数量减少，被测序 2次的概率增大，duplication 率显然也会增高。
到这里已经可以很明白的看出 duplication 率主要与文库中 unique 分子数量有关，所以建库过程中最大化 unique 分子数是降低 duplication 率的关键。文库中 unique 分子数越多，说明建库起始量越高，需要 PCR 的循环数越少，而文库中 unique 分子数越少，说明建库起始量越低，需要 PCR 的循环数越多，因此提高建库起始量是关键。
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原文地址：https://www.cnblogs.com/zdwu/p/9706175.html
