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Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。
Smart-seq
SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一个具有里程碑意义的重要技术。实际上，能够从单细胞生成全长cDNA的测序方案并不多，Smart-seq就是其中之一。对于等位基因特异性表达或者剪接变体研究来说，覆盖整个转录组是一件非常重要的事情。
Fluidigm C1单细胞制备系统能够自动完成Smart-seq步骤。你只需要将制备好的细胞悬液加进去，仪器就会分离并裂解细胞，把mRNA逆转录为cDNA，再对cDNA进行扩增。扩增后的cDNA可以拿来测序，也可以进行qPCR检测。
在Enard的比较研究中，Fluidigm C1系统的Smart-seq最为灵敏，成本也最高。这一系统使用的微流体芯片不能重复使用，不过这种芯片可以放到显微镜下观察，证实健康单细胞的存在。
CEL-seq
CEL-seq（Cell expression by linear amplification and sequencing）是一种采用线性扩增的常用测序方法。线性扩增的主要优势是错误率比较低，不过线性扩增和PCR都存在序列依赖性偏好。
CEL-seq技术发表于2012年，主要是分离单细胞，逆转录带有poly-A 尾巴的mRNA片段，给它们贴上代表其细胞来源的条码。2014年Science杂志发布的MARS-seq与CEL-seq很类似。
CEL-seq和其他线性扩增方法生成文库花费的时间要稍微长一点。不过，CEL-seq在早期阶段就给样本贴上条码并进行混合，大大减少了手动操作的时间。PCR是在最后阶段使用的，主要是为了连接正确的测序接头，CEL-seq开发者纽约大学的Itai Yanai介绍到。
CEL-seq所需试剂都是现成的，大约两天时间生成测序文库和测序数据，Yanai指出。需要注意的是，CEL-seq与大多数方案一样，测序转录本的3’端。Enard等人并没有亲自尝试着一技术，只是在比较研究中用到了CEL-seq数据。从这项研究来看，CEL-seq的重现性最好。
GitHub网站提供有CEL-seq可用的生物信息学工具。Yanai研究团队正在开发新版本CEL-seq2，新版本的灵敏度将比旧版本高三倍。
SCRB-seq
Broad研究所开发的SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing）技术采用的是PCR扩增。该技术需要结合流式细胞仪（FACS）或者其他细胞分选方法，把单细胞分配到微孔里去。
SCRB-seq与Smart-seq比较相似，只不过SCRB-seq会整合特异性的细胞条码，以分辨扩增分子的来源，更准确的定量转录本。此外，SCRB-seq并不生成全长cDNA，而是像CEL-seq一样富集RNA 3’端。
2014年，开发者们将SCRB-seq技术提前发布在BioRXiv上。随后他们对这一技术进行了更新，并将其更名为“high-throughput eukaryote 3’ digital gene expression”。Broad研究所仍提供有SCRB-seq技术服务，SCRB-seq也被整合到了Wafer GenBio systems公司的scRNA-seq平台上。据说Fluidigm公司的C1系统很快也将支持SCRB-seq方案。SCRB-seq目前是Enard最中意的测序方法，它不仅适用于单细胞RNA测序，还能支持大量细胞（bulk）的RNA测序。可惜的是SCRB-seq并不好DIY，研究者自己很难将测序流程与FACS对接起来。
DROP-seq和inDROP
哈佛医学院的研究人员开发了以微滴为基础的两种独立技术Drop-seq和inDrop。他们利用微流体装置将带有条码的微珠和细胞一起装入微小的液滴，建立了快速、廉价、高通量的单细胞RNA-seq方法。这两种技术将细胞隔离在微小的液滴中，装上用于扩增的条码引物，由此检测数以千计的细胞。研究者们认为，Drop-seq和inDrop能够帮助生物学家进一步发现和分类人体细胞，绘制大脑等复杂组织的细胞多样性图谱，更好地了解干细胞分化，获得更多疾病的遗传学信息。
Enard及其同事发现，Drop-seq在单个细胞中检测的基因数还不到Smart-seq/C1、CEL-seq和SCRB-seq的一半。不过，在统计学水平上研究差异性表达的时候，高通量Drop-seq和SCRB-seq是最划算的。哈佛医学院Steve McCarroll实验室去年下半年根据用户反馈，在自己网站上公布了3.1版的Drop-seq（mccarrolllab.com/dropseq）。
参与开发SCRB-seq的Stefan Semrau正在搭建自己的Drop-seq平台。Semrau从Whitehead生物医学研究所搬到Leiden物理研究所的时候，发现自己用FACS已经不那么方便了，于是他为新实验室选择了Drop-seq。建立微流体芯片和液滴系统是整个过程中最艰难的部分，不过Semrau实验室的一名微流体博士后仅用三周就搞定了这些问题。Drop-seq文库制备是任何分子生物学研究者都熟悉的标准操作。据Semrau估计，搭建和优化Drop-seq大概只需要六个月时间。
四种单细胞RNA-seq方法比较

Synthesising Executable Gene Regulatory Networks from Single-Cell Gene Expression Data

https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-21690-4_38

Decoding the Regulatory Network for Blood Development from Single-Cell Gene Expression Measurements

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4374163/

综述

Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics

https://www.nature.com/articles/nrg3833

Bioinformatics approaches to single-cell analysis in developmental biology.

https://academic.oup.com/molehr/article-lookup/doi/10.1093/molehr/gav050

https://academic.oup.com/molehr/article/22/3/182/2459767

Single-cell sequencing in stem cell biology

Lu WenEmail author andFuchou TangEmail author
Genome Biology201617:71
DOI: 10.1186/s13059-016-0941-0
? Wen and Tang. 2016
Published: 15 April 2016

 Application of single-cell genomics in cancer: promise and challenges

scale of Single cell data

http://bix.ucsd.edu/projects/singlecell/nbt_data.html

http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/early/2016/04/18/bioinformatics.btw201

Single-cell RNA-sequencing: The future of genome biology is now.

http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15476286.2016.1201618?scroll=top&needAccess=true

A survey of best practices for RNA-seq data analysis

Single-cell genomics: coming of age

SINGLE CELL GENE EXPRESSION FOR DIAGNOSIS, PROGNOSIS AND IDENTIFICATION OF DRUG TARGETS