HISAT2,StringTie，Ballgown处理转录组数据思路如下：

1. 数据质控
2. 将RNA-seq的测序reads使用hisat2比对
3. samtools将sam文件转成bam，并且排序，为下游分析做准备
4. stringtie对每个样本进行转录本组装
5. stringtie 将所有样本的转录本进行合并 注意：此处的mergelist.txt是自己创建的
6. 计算表达量并且为Ballgown包提供输入文件
7. Ballgown的安装 分析，需提供一个分组信息；

０．数据质控(QC)：
Ubuntu软件包内自带Fastqc,故安装命令apt-get install fastqc
fastqc命令：
fastqc -o . -t 5 SRR3101238_1.fastq.gz &
-o . 将结果输出到当前目录
-t 5 表示开5个线程运行
(四个样本，双端测序，要分别对八个fastq文件执行八次)

１．将RNA-seq的测序reads使用hisat2比对
准备软件：
安装HISAT2
下载地址：
http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/downloads/
wget http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/downloads/hisat2-2.0.0-beta-Linux_x86_64.zip -P ./
解 压 缩：
unzip hisat2-2.0.0-beta-Linux_x86_64.zip

准备文件：

1. 参考基因组序列；genome (chr.fa)
2. 参考基因组的注释文件;genes (chr.gtf)
3. Hisat2索引文件；indexes (chr_tran.1.ht2)
4. 测序数据；samples (chr_1.fastq.gz, chr_2,fastq.gz;样本表型信息 与 样本列表)

下载人类参考基因组和注释文件：
1.1 人类参考基因组：Hisat2官网上有Ensemble GRCh38的基因组索引, 链接：http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml
1.2 注释文件：下载自ensemble数据库ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-86/gtf/homo_sapiens
1.3 索引文件的创建:从gtf文件中构建索引，命定如下：
extract_exons.py hg19.annotation.gtf > exons.txt
extract_splice_sites.py hg19.annotation.gtf > splicesites.txt

创建索引另外一种方法：
hisat2-build [options]*<reference_in><ht2_base>

<reference_in>:用于指定参考基因组；

<ht2_base>:用于指定生成的索引文件的基名；

./hisat2-2.0.0-beta/hisat2-build -f ucsc.hg19.fasta –ss splicesites.txt –exon exons.txt -p 7 ./ucsc.hg19

#添加–ss和–exon选项后，需要很大的内存，build 人基因组的话需要200G RAM，如果没有这么大内存，不要添加这两个选项,但要在后续运行hisat时添加 –known-splicesite-infile选项（见下文）
如hisat2-build -f ucsc.hg19.fasta -p 7 ./uscs.hg19 ##大概需要一小时二十分钟

(1). 比对，生成bam文件：“将RNA-seq的测序reads使用hisat2比对对参考基因租组”
hisat2 -q -x ./ucsc.hg19 -1 reads_1.fastq -2 reads_2.fastq -S alns.sam -t

hisat2 -q -x ./ucsc.hg19 -1 reads_1.fastq -2 reads_2.fastq -S alns.sam –known-splicesite-infile splicesites.txt -t

-x :用于指定参考基因组所对应的索引文件；

-1, -2: 用于指定测序 Reads 所在的文件；

-S:用于指定存储比对结果的文件名；

-p: 用于指定线程数;

(2) Sort and convert the SAM files to BAM

samtools sort -@ 8 -o ERR188044_chrX.bam ERR188044_chrX.sam

-@:用于指定线程数;

-o:用于指定存储转化结果的文件名；

注：*.bam 格式的文件为二进制文件；

在-b 指定的文件夹下生成特定的文件
e2t.ctab
e_data.ctab
i2t.ctab
i_data.ctab
t_data.ctab
e即外显子、i即内含子、t转录本；
e2t即外显子和转录本间的关系，
i2t即内含子和转录本间的关系，
t_data即转录本的数据

(3) assemble and quantify expressed genes and transcripts

stringtie -p 8 -G chrX_data/genes/chrX.gtf -o ERR188044_chrX.gtf -l ERR188044 ERR188044_chrX.bam

-G :用于指导组装过程的参考注释的文件；

-o:用于指定存储组装结果的文件名；

-l: 为转录本的ID指定前缀；

-p: 用于指定线程数;

(4) Merge transcripts from all samples:

stringtie –merge -p 40 -G chrX_data/genes/chrX.gtf -o stringtie_merged.gtf chrX_data/mergelist.txt

-G :用于指导组装过程的参考注释文件；

-o:用于指定存储组装结果的文件名；

-p: 用于指定线程数;

注： mergelist.txt 文件包含所有*.gtf 文件名的列表， 并且每个文件名占据一行。

(5) Examine how the transcripts compare with the reference annotation (optional)

./bin/gffcompare -r chrX_data/genes/chrX.gtf -G -o merged stringtie_merged.gtf

-r :用于指定参考的注释文件；

-o:用于指定存储结果的文件名的前缀；

-G:用于指定是否比较所有转录本（即使是冗余的）；

(6） Estimate transcript abundances and create table counts for Ballgown

stringtie -e -B -p 48 -G stringtie_merged.gtf -o ballgown/ERR188044/ERR188044_chrX.gtf ERR188044_chrX.bam

-e:用于指定是否仅为参考转录本估计表达丰度；

-B:用于指定是否输出 Ballgown table 文件；

-p: 用于指定线程数;

-G :用于指定已组装的注释文件；

-o:用于指定输出结果的文件名；