标签：因此 image 检测 ecif 破坏 细节 异常 标记 中国
期刊名：Journal of Proteome Research
发表时间：(2019年9月)
IF：3.78
单位：
物种：人血浆
技术：用组氨酸修饰的具有可变换表面电荷的亲水性智能材料(组氨酸键合的二氧化硅，HBS)可选择性地从复杂的生物样品中富集唾液酸化的糖肽(SGP)
一、 概述：
糖蛋白的异常唾液酸化与许多恶性疾病密切相关，唾液酸化的分析对于揭示这些疾病的现状具有很大的潜力。然而，深入分析唾液酸化仍然具有挑战性，因为蛋白质糖基化具有高的微观异质性而且唾液酸化糖肽的丰度低。在这里，通过使用唾液酸化糖肽富集为糖蛋白唾液酸化在糖基化位点和特异位点上的糖型方面的详细表征制定了一个综合方法。该方法在6微升血清中可以识别多达380个糖基化位点以及对应于383个位点特异性糖型的414个完整糖肽，这表明该糖蛋白唾液酸化详细分析方法的灵敏度高。这个方法被进一步用于肝细胞癌患者与对照样本糖蛋白唾液酸化的差异分析，同时得到344个糖基化位点和405个特异性位点糖型的定量结果。结果显示43个糖基化位点和55种位点特异性糖型分别在位点水平和位点特异性糖型水平上发生显着变化。有趣的是，同一糖基化位点上的一些糖型被发现有不同的变化趋势。该方法被证明是一种强大的可以揭示糖蛋白唾液酸化的宏观和微观异质性微妙差异的工具。
二、 研究背景：
唾液酸化作为一种??特定形式的糖基化，在调节蛋白之间的相互作用中扮演着重要角色，唾液酸化的异常与免疫疾病、耐药性、肿瘤侵袭和诸如此类的疾病紧密相关。因此，评估和比较癌症病人和健康人中唾液酸化的变化具有重要意义。据报道糖结构唾液酸化的增加似乎在癌症发展的糖组学分析和糖基化位点占有率中具有指示作用。众所周知，糖基化修饰可以在多个糖基位化位点上发生，另外，不同的唾液酸化的糖可以连接到相同的位点，这就是唾液酸化的宏观和微观异质性。不幸的是，大多数专注于糖结构或糖基化位点的分析研究只能揭示不同糖基化位点上的糖的平均结果和所有糖型的糖基化位点的占有率，而唾液酸化细节上的异质信息在此过程中就丢失了。
血清样品或细胞裂解液的消化液中含有的完整唾液酸化糖肽包含的信息有：糖结构，肽段序列和糖基化位点，这些能让我们确定特定位置的唾液酸化糖型。因为完整的唾液酸化糖肽与大量的非糖肽共存，所以很难在复杂的蛋白混合消化物中检测到完整的唾液酸化糖肽，因此需要在蛋白消化物中对它们进行特异性富集。通过利用唾液酸的选择性氧化，肼化学已被广泛用于N连接或者O连接完整唾液酸化糖肽的高特异性富集。但是，唾液酸化的信息会在氧化过程中丢失。因此，它不适用于分析完整唾液酸化糖肽。二氧化钛色谱法可富集完整唾液酸化糖肽且不会破坏唾液酸结构。然而，这种方法有特异性和效率方面的缺点。在我们最近的工作中，一种具有可转换表面电荷的亲水性智能材料（组氨酸键合的二氧化硅)被报道可以从复合生物样本中选择性富集完整唾液酸化糖肽。这种富集方法是基于完整唾液酸化糖肽的高亲水性和负电荷性，并且糖肽的完整性在富集过程中可以得到保持，这适用于糖基化位点和位点特异性糖型的同时分析。
除了完整唾液酸化糖肽的富集，通过质谱技术来鉴定完整糖肽特异性位点糖型的唾液酸化分析也很困难。我们的实验室发展了一种基于配对图谱的方法，这种配对是通过合并糖肽和该糖肽去糖基化后的图谱实现的。这两种图谱通过保留时间差和质量偏差匹配，这种方法可以提高完整糖肽的鉴定效率。然而，唾液酸可能会增加完整糖肽在长梯度液相色谱-串联质谱中的保留时间，这会导致测定完整唾液酸化糖肽的高假阳性发现率。到目前为止，其他策略，例如pGlyco2.0和SugarQb都开发来鉴定完整糖肽。其中，据报道pGlyco2.0在识别完整糖肽上表现良好，它不依赖于糖肽保留时间，因此增加的唾液酸保留时间对完整唾液酸化糖肽的假阳性发现率没有影响。因此，pGlyco2.0是在位点特异性糖型水平上分析糖蛋白唾液酸化的理想选择。如上所述，对糖位点和特定部位糖型的详细分析,可以为人类癌症的早期诊断提供潜在的生物标记物，以及增强生物标志物的特异性和敏感性。在这项研究中，我们通过利用具有特异性和高效率特征的完整唾液酸化糖肽富集方法，提出了一个能同时分析糖基化位点和位点特异性糖型的整合的工作流程。
三、 实验设计：
四、研究成果：
1、液质联用对去糖基化糖肽的两次重复分析结果显示在189个糖蛋白中鉴定到380个N连接糖基化位点。每次重复分析仅用到1.5微升的血清样品。为了进一步确定完整的唾液酸化糖肽，pGlyco2.0软件被用来分析完整糖肽的MS二级图谱。结果显示，两次重复分析中鉴定到405个完整的糖肽和383个位点特异性糖型。另外，发现几乎99％（378/383）的位点特异性糖型含有末端唾液酸，前十大高丰度的糖都被唾液酸化修饰。
图 1. 100个正常人血清样本池中唾液酸化的N连接糖基化位点(A)和位点特异性糖型(B)的鉴定；完整糖肽中鉴定出的前10种高丰度糖型的分布(C)
2、在正常人（对照）和肝细胞癌患者的血清中，共分别鉴定到434和389个糖基化位点。这其中来源于39个糖蛋白的43个糖基化位点有显著的唾液酸修饰变化。在肝细胞癌患者的血清样本中，它们中的18个糖基化位点明显增加，25个糖基化位点明显减少。对正常人和肝细胞癌患者血清的三次分析中共分别鉴定471和365个位点特异性糖型（1.5μL/次，3次总计4.5μL），同时在正常人和肝细胞癌患者血清的三次分析中共发现434和389个N连接的糖基化位点。
表格 1. 肝细胞癌患者和正常人血清中变化显著的唾液酸化的糖基化位点数量
图 2. 从对照（A）和肝细胞癌患者(B)血清中鉴定出N连接糖基化位点（三次分析），三次分析对照（C）和肝细胞癌患者(D)血清中共有的唾液酸化位点特异性糖型
3、在两组样品中（肝细胞癌患者和正常人血清），一共定量了405个位点特异性糖型。这其中，14个糖基化位点上的19个经过唾液酸修饰的糖型在肝细胞癌患者血清中显著增加，33个糖基化位点上的36个经过唾液酸修饰的糖型在肝细胞癌患者血清中显著减少。另外，有一些糖基化位点上的糖型既增加又减少。例如，触珠蛋白相关蛋白第126位天冬酰胺上连接的糖型己糖（5）N-乙酰己糖胺（4）唾液酸（1）岩藻糖（3）在肝细胞癌患者血清中就增加了，而在相同位点的另一糖型己糖（7）N-乙酰己糖胺（5）唾液酸（2）岩藻糖（2）在该样品中就降低了。
表格 2. 肝细胞癌患者和正常人血清中变化显著的唾液酸化的位点特异性糖型数量
图 3. 肝细胞癌患者和正常人血清中连接在触珠蛋白相关蛋白第126位天冬酰胺上糖的变化趋势（A），相同糖型在不同蛋白不同位点上的变化趋势（B）（红色表示在肝细胞癌患者血清中增加，绿色表示在肝细胞癌患者血清中降低，黑色表示无显著变化，数字表示糖基化位点的位置）
五、文章亮点（结论讨论）：
总之，我们提出了一种在糖基化位点和位点特异性糖型水平上分析唾液酸化的综合策略，它可以同时绘制出糖蛋白唾液酸化的宏观和微观异质性。通过这一策略，总共从人血清样本中759个完整糖肽中鉴定到714个位点特异性糖型。我们观察到一些糖基化位点在相对位点占有率和位点特异性糖型水平上具有不同的变化趋势。这个平台已被证明是深入分析人血清糖基化宏观和微观异质性的强大工具。因此，它在筛选人类早期癌症诊断新型生物标志物方面具有巨大的潜力。
阅读人：陈秋实
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原文地址：https://www.cnblogs.com/ilifeiscience/p/11619848.html
