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Mapping human cell phenotypes to genotypes with single-cell genomics
摘要
身体所有细胞的累积活动，以及它们无数的相互作用、存亡历程和环境变化，产生了人类个体特有的性状。对人类细胞类型进行分类，了解它们是如何发展的，它们在个体之间是如何变化的，以及它们在疾病中是如何失去正常功能的，这是一个长期的目标。单细胞基因组学彻底改变了这一领域的发展，因为基于测序的方法提供了一种基于高信息含量和高通量测量来定量注释细胞状态的手段。随着干细胞生物学和基因编辑的进步，我们正处在一个迷人的旅程中，去了解构成人体的细胞表型，以及人类基因组是如何被用来构建和维持每个细胞的。在这里，作者概述了单细胞基因组学是如何被用来开发个性化表型方案的最新进展，这些策略跨越亚细胞、细胞和组织的尺度，将我们的基因组与我们累积的细胞表型联系起来。
前言
“表型”可以指很多东西，但总的来说，它是一种对个体基因组与环境相互作用而产生的一系列属性进行分类的方法。这是一种再生产的方法，但很有效，可以将人类表型降低到单细胞水平，并利用细胞内的分子状态在分子、细胞、组织和系统水平上建立表型。单细胞测序技术可以一次测量成千上万个细胞中的成千上万个特征，提供构成人体组织、器官或其他生物系统的细胞和分子状态的定量和超高分辨率快照。目前，已有一些方案可用于测量单细胞中的RNA含量、DNA序列和甲基化状态、染色体结构和可及性以及蛋白质组成(1)。除了分子特征之外，细胞的历程可以通过测定某些起源于细胞核或线粒体的突变来区分不同的谱系。此外，在遗传易处理的模型系统(如小鼠、斑马鱼和类器官)中，通过使用报告条形码（reporter barcode）和基于RNA-guided的CRISPR相关的Cas技术，可以记录细胞命运的历史并推断谱系树。到目前为止，在每个实验中，通常使用一种或两种单细胞测量技术来测定组织内单个细胞的表型。然而，该领域正朝着从同一细胞中获取转录组、基因组、表观基因组和谱系状态的多模式测量方向发展，以增强特征识别并在任何给定时刻给出细胞表型的更丰富图像(10，12)。这些技术正迫使科学家们努力应对以前的“细胞类型”概念，因为细胞特性可以离散变化(类型或亚型)，也可以连续变化(状态)，分类可能不总是遵循严格的等级制度(13)。从而导致在开发研究细胞状态和组织形态随时间快速变化的系统中又增加了一层复杂性。单细胞测序捕捉瞬时状态，而公认的方法是能够实现细胞轨迹(14)和谱系(9)的重建。
每个细胞的微环境也可能对单个细胞的表型至关重要。基于多重核糖核酸杂交(15，16)或蛋白质免疫组织化学(17)、原位测序(18，20)、质量细胞计(21)或其他策略(22)的空间转录和蛋白质组学方法可用于原位测量细胞类型和状态。此外，正在研发的新方法，通过使用条形码寡核苷酸来分析细胞内和组织内细胞的空间位置，当分子足够接近以物理相互作用时，条形码寡核苷酸可以偶联在一起(23，24)。这些成对的相互作用被编码在DNA中，可以用高通量测序来测量，计算分析能够基于分子邻近性对细胞相互作用进行空间重建。
单细胞表型测定已经提供了跨越同一模式生物不同器官系统(25，27)的非常规图谱，将细胞的形态与分子特征(28)关联起来，在空间上解析细胞类型的分类(18，29)和细胞的状态梯度(30，31)，并通过使用谱系记录(7)绘制相似的细胞命运图。这正逐渐扩展到发育中、成熟和老化的人体器官(32，33)；识别先前未记录的人类细胞类型(3436)或其它状态提供定量框架(37，38)。主要技术目标是整合(39，40)所有可能的特征检测方法(例如RNA，DNA、染色质状态和谱系)在单细胞中独立或同时组合进行，并将这些测量结果呈现在具有亚细胞和时间分辨率的三维(3D)空间中(图1)。通过用这种高信息含量技术解析细胞的异质性，可以在环境和遗传条件下，比较组织或生物系统水平(系统表型)上出现的表型变化，如组成、调节状态、细胞相互作用、空间结构和不同的分化轨迹等。因为人类的发展不是决定性的，所以观察器官重建在不同的人身上是如何变化的将是一个有趣的问题。与人类基因组计划相似，当每个人的器官看起来不同时，人类细胞图谱（Human Cell Atlas，HCA）将面临如何生成参考器官图的挑战。通过综合使用多种单细胞测量方法来评估这种变化的过程已在HCA项目中提出，将有助于为组织取样、样本和数据处理以及方法和个人之间的计算比较创建共同的协调框架。
疾病相关的细胞表型
当每个人和小鼠的器官在空间和时间上以单细胞分辨率被映射时，下一阶段的研究是了解基因变化如何影响人类的表型。疾病关联研究使用自然发生的突变来鉴定致病基因；这些基因是符合孟德尔遗传模式的，是具有强效应的编码突变，或者已经过实验验证。致病基因可以通过识别表达该基因的细胞群而被定位到细胞类型中如[多器官(41)、肾脏(42)、皮层(43)]等(图2A)。一个值得注意的例子是，最近研究人员绘制成人类肺中的细胞类型，并鉴定了一种新的人细胞类型(“离子细胞”)，这是唯一一种高表达囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的细胞类型，因此可能介导囊性纤维化中观察到的肺病理(35，36)。然而，通过全基因组关联研究发现的大多数疾病相关突变可能是调节性的，它们调节的基因目前还不清楚。结合单细胞水平的DNA、RNA和染色质多模式测量，可以定位在特定细胞类型或状态下活跃的基因组部分，从而提供从调节基因到细胞甚至组织表型的联系。细胞和细胞群体测量的未来探索将在单细胞水平研究组织的表型(44，45)，类似于从基因型-组织表达(GTEx)项目(46)中使用成年人器官的大规模RMA测序所做的，对于解析大多数全基因组关联分析（GWAS）鉴定到的变异作用机制至关重要。
此外，研究人员已经开始对人类患病组织进行表型鉴定(图2B)，阐释肌萎缩性侧索硬化症中的空间神经胶质细胞的相互作用(47)，鉴定阿尔茨海默病中与疾病相关的小胶质细胞(49) (48)和关节炎中的成纤维细胞(49)，健康和2型糖尿病(50)中的胰岛图谱，以及结肠炎(51)中的细胞重连。这些类型的分析有助于实现分子疾病的分类和诊断进入新的阶段，并指导针对特定疾病所影响的特定细胞类型治疗方法的发展。这已经在各种癌症中开展(52)；然而，在将单细胞测序技术应用于临床范围内的其他疾病患者方面，仍存在重大挑战，需要不断创新。最小化细胞损失的技术可以使在实验中仅需少量的输入材料(53)成为可能。除了癌症之外，很难从患者的大多数患病微环境中获取组织，也很难从健康人群中获取微型活检组织的患病区域，从而可能会导致缺乏清晰的疾病分子表型。因此，还需要实现从样品制备和测序到数据分析的单细胞组学流程的产业化。这可以包括方案优化，以降低细胞通量的成本，同时保持灵敏度(25，54，55)，基于参考多态性(45)或标记(56，57)增加样品复用，并通过实验富集来压缩表型以用于诊断特征或根据非诊断特征进行选择(58)。一旦方法已经工业化，原位顺序方法可能是增加通量的另一种途径。最后，需要好的软件分析流程，能够快速解析高维数据并输出能够诊断疾病的准确结果。
将人类与小鼠和其他物种进行比较，可以揭示模式生物在理解人类基因型与表型关系中的能力和局限性。在许多情况下，在哺乳动物组织中发现同样广泛的细胞类别，并且细胞状态可以实现跨物种整合(39)。例如，最近对小鼠肾脏的单细胞分析表明，人类中大多数已知的肾脏疾病相关基因都对应于小鼠肾脏细胞(59)。然而，在一些情况下，人和小鼠组织在细胞组成和基因表达方面已经发生了显著的分化。例如，人类和其他灵长类动物有一个称为视网膜中央凹的特殊区域，它可以根据视网膜神经元的特定比例和类型来区分，这些神经元具有不同于视网膜其他区域的表达特征(60)。然而，小鼠却完全没有视网膜中央凹，这使得它成为许多失明疾病的一个糟糕模型系统。或许有可能利用这些差异来理解控制人类细胞表型的潜在遗传机制。总之，物种之间、人类个体之间以及健康和疾病状况之间的比较，可以阐明多种人类细胞表型，并有助于将基因组与特定的细胞状态联系起来。现在，我们需要开发创造性的战略来超越相关性，并从这些高分辨率的图谱中建立观测功能的相关性。
干细胞和基因干预工具
干细胞生物学领域发生了一场激动人心的革命，使得在受控的2D培养物(61)中产生多种人类细胞类型和产生类似于原始组织或器官的对应物(称为类器官，organoids)(62，63)。例如, 已经为脑、肝、内脏、肺、肾和胃的不同部分开发了类器官方案，并且这些方案正在针对定型形态学(64)和类器官间的再现性(65，66)进行优化。这些系统中的许多已经通过单细胞基因组学进行了分析，并且数据与它们的原始组织对应物进行了比较，以定量细胞状态重新矫正准确度(67)。这些体外系统的优势，在于它们对个体具有特异性，能够在一段时间内进行重复测量，能够在不同的环境条件下进行遗传操作和相关记录，能够用于高通量筛选，并能够概括某些疾病表型(图3)。例如，最近的研究表明，在脑室周围结节性异位和单细胞转录组患者中观察到的大脑器官样物质概括了神经迁移缺陷，确定了扰动的不同识别轨迹(68)。此外，大脑类器官被用来识别对早产缺氧条件敏感的特定细胞状态，而类器官物质被用来筛选防止这些细胞状态丢失的小分子(69)。综上所述，将多个单细胞基因组测量方法与细胞历史记录器和三维空间重建相结合，将能很快在这些个体化疾病模型中提供非常令人兴奋的高分辨率表型策略。
体外培养系统能够再现人类晚期的发育和生理状态，使研究人员能够使用RNA-guided Cas核酸酶来研究这些系统，并将基因型与表型联系起来。CRISPR-Cas核酸酶具有多种天然和合成工程特性，能够实现不同的基因组和表观基因组修饰(70)。这些工具最初是基于Cas9蛋白建立的，用于永生哺乳动物细胞系的基因编辑(7173)，然后利用正向和反向遗传学方法将表型与基因型联系起来(图4)。基于CRISPR的反向遗传方法，通常称为集合CRISPR筛选，包括(i)基因组规模或亚基因组指导核糖核酸(gRNA)文库的产生；(ii)对细胞的感染传递的多样性较低，使得单细胞受到单一扰动；(iii)基于感兴趣的细胞表型(如增殖、死亡或选择性标记或报道物的存在或不存在)的细胞富集或耗竭；和(iv)鉴定和分析对应于富集和/或缺失的gRNAs的基因。Pooled CRISPR筛选最初在人类癌细胞系(74，75)中得到证实，但最近在人类诱导多能干细胞(iPSC)培养系统中得到扩展和优化，以鉴定调控基因多能性(76)。基因敲除之外，融合到效应结构域的催化失活的Cas蛋白实现了多种干扰，包括转录激活(CRISPRa)或抑制(CRISPRi) (77)、DNA甲基化或去甲基化(78)、组蛋白乙酰化(79)、DNA(80)或RNA(81)碱基编辑，以及其他(82)。许多这种由RNA-guided的Cas效应蛋白已经成功地用于CRISPR的混合筛选，进一步扩展了我们将不同的遗传和表观遗传特征与现象类型联系起来的能力(77，8385)。研究人员已经开始通过建立稳定的细胞系将这些技术引入人类iPSC细胞，这些细胞系可诱导不同Cas效应子的表达，然后这些细胞系可用于探索人类细胞和组织环境多样性中的表型-基因型关系。(5，86，87)
最近，一些激动人心的工作将CRISPR筛选与单细胞基因组测序技术(88，91)结合起来。在这些方法中，pooled的gRNAs和一种Cas蛋白一起被导入细胞，这样细胞就能表达不同的gRNAs。转录本可以在单细胞中测序，每个细胞表达的gRNA可以根据相关的条形码或通过gRNA的直接测序来确定。通过这种方式，许多不同基因干扰的效果可以在同一个实验中进行单细胞水平的检测。在设计类器官内的单细胞干扰时，有几个考虑因素，对初始技术进行优化以减少条形码重组将使读数更加灵敏和准确(92)。人们需要基于效果分析来确定有多少基因可以被靶向，效果分析考虑了系统的细胞异质性(细胞数量)、突变型和野生型细胞的比例、测序深度、每个细胞的read数、扰动影响的大小和成本。干细胞培养物或类器官体内的克隆选择会对结果产生影响，尤其是当类器官系统是由许多不同干细胞克隆(如大脑器官样)的复合物启动时。Cas蛋白可通过多种策略(如Tet-On或Cre)组成性或短暂性挤压或诱导，gRNAs可通过不同方法(腺相关病毒、慢病毒或转座子)导入细胞或类器官。目前，gRNA或条形码需要被读出，而不是基因组损伤，使读出相关。如果突变细胞的比例太高，那么类器官可能不能正常发育，并且存在足够比例的野生型细胞可以缓冲突变效应。因此结合接收gRNA的细胞选择特征(例如荧光) 很重要。最后，遗传扰动可能是细胞自主的或非细胞自主的，这在具有镶嵌器官的混合筛选中很难区分，使得阵列筛选成为重要的选择。基于iPSC衍生的类器官中单细胞测序的CRISPR-Cas9筛选，在探索人类细胞表型-基因型关系方面具有广阔的前景。这将有可能通过创新来提高产量以进行组合遗传相互作用和大规模多重筛选，通过新技术将筛选与分子记录(7，93)和谱系追踪相结合，以及通过基于原位测序技术的原位测序技术(94)来揭示遗传扰动的空间效应。
结论和展望
在这篇综述中，作者旨在以单细胞基因组学为基础来概述人类器官和类器官的表型分类，以及CRISPR-Cas技术如何使表型在功能上与人类基因组的相关区域联系起来。单细胞基因组学现在处于描述阶段，可为每个健康人的组织进行细胞表型的分类，最终通过计算机以4D模拟的方式来解决，使研究人员能够走进组织内部，在特定时间点定位组织内某一位置的细胞，并了解其分子特征及其与微环境中其他细胞的相互作用。在短期内，我们的目标是将不同的特征(RNA、DNA、染色质状态和谱系)测量结果整合到具有亚细胞和时间分辨率的三维空间中。将单细胞分子测序与细胞和亚细胞解决方案(95，98)，还有清晰的人体器官和类器官的完整成像技术结合起来将会产生令人兴奋的研究结果。虚拟现实显微镜的创新开始已开始将拟真的可视化和通过手势控制的基于图像的数据模拟结合起来，实现了第一个用于单细胞基因表达数据的可视化和分析的虚拟现实平台(99)。
人类细胞中的扰动筛选可与4D时空模型整合，以衡量基因和调节区的功能相关性，从而建立分子、细胞和系统级的表型。然而，在干细胞和类器官领域仍有许多限制需要更新，这将深化可获得的生物学解析。具体而言，类器官形态可能不是定型的，存在缺失或偏离目标的谱系，类器官没有与其他相关器官系统整合，iPSC衍生的类器官随着发育而变化，或许不能反映真实人类中的过程。继续使用单细胞基因组学来评估新的类器官方案的准确性，并将谱系图和命运图与其他哺乳动物的对应图进行比较，将显得非常重要。建立来自不同人群(100)或参考图谱相同个体的干细胞资源，将有助于建立跨方案定量比较的基础。此外，能包含各种类型的CRISPR-Cas系统、以及用于基因扰动筛选和细胞命运记录的特征良好的iPSC lines，还有一套多样的荧光报告器(101)，将极大推动该领域的发展。
最后，在患病组织和类器官模型上实现单细胞测序的产业化，将为疾病分类和个性化医学带来令人兴奋的前景。这需要基础和临床研究人员之间的密切合作，以及行业合作伙伴，以确定单细胞测序可能产生最直接影响且未满足的医疗需求。已知多种遗传因素驱动的疾病有很多；然而，越来越清楚的是，不同的致病基因在非常不同的细胞类型中表达(102)。这是一个主要的难题，在这个难题中，对原发组织和/或类器官模型中的无序状态进行分子解剖，可以对无序状态进行精确分类，也可以识别出隐藏特定疾病表现的机制。类器官方案的优化以及单细胞基因组学通量的增加，也能检测疾病相关的环境条件和潜在的药理学、基因和细胞疗法。虽然还有许多障碍存在；但这个领域正以非同寻常的速度向前发展，它将走向何方，是非常令人兴奋的。
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