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如何选择紫外/可见分光光度计

时间:2015-03-18 13:41:37      阅读:295      评论:0      收藏:0      [点我收藏+]

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一、分光光度计的工作原理 

    分光光度法是根据被测物质分子对紫外、可见波段范围单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法。 

    物质呈现特征的颜色,这是由于它们对可见光中某些特定波长的光线选择性吸收的缘故。实际上,一切物质都会对可见光和不可见光中的某些波长的光线进行吸收。但是,一切光线并不都是以相同的程度被物质吸收的。物质对不同波长的光线表现不同的吸收能力,叫做选择性吸收。各种物质对光线的选择性吸收这一性质,反映了它们分子内部结构的差异,即各种物质的内部结构决定了它们对不同光线的选择吸收。 

    朗伯-比耳定律 (Lambert-Beer)是几乎所有的光学分析仪器的基本工作原理,它由朗伯定律和比耳定律合并而成。  

    朗伯定律表明:如果溶液的浓度一定,则光对物质的吸收程度与它通过的溶液厚度成正比。  

    比耳定律表明:如果吸光物质溶于不吸光的溶剂,则吸光度和吸光物质的浓度成正比。  

两者合成后的数学表达式如下:  

      T=I/I。 (1)  

      A=KCL=‐㏒ I/Io 2)  

其中  

    T 透过率  

    A 吸光度  

    C 溶液浓度  

    K 溶液的吸光系数  

    L 液层在光路中的长度   

    I 光透过被测试样后照射到光电转换器上的强度  

    Io 光透过参比测试样后照射到光电转换器上的强度  

二、产品类型结构: 

光度计 

      可见分光光度计   

           紫外/可见分光光度计     

                 扫描型紫外/可见分光光度计 

                        双光束紫外/可见分光光度计  

三、仪器技术参数解释 

    波长范围:仪器可选波长的测量范围。不同的物质吸收所对应的吸收波长不一样。  

    氘灯:紫外光源                    185-400nm  

    钨灯:可见和近红外光源      250---2000nm               

    光谱带宽:目前国际上对光谱带宽的测试方式一般用“谱线轮廓法”,主要是选用某些光源的特征谱线,对它进行光谱扫描,绘出该谱线的轮廓,再测出该谱线的半峰高的宽度即为光谱带宽(又称自然光谱带宽)。仪器使用的光谱带宽通常要比自然光谱带宽小10倍以上。 

    波长准确度:也叫波长精度,是波长的实际测定值与理论值的差值。 

    波长重复性:多次测量(一般是3次)最大值与最小值之间的差值。 

    光度准确度:光度测量值与光度理论值之差。  

    影响光度准确度的主要因素:  

    ①杂散光②光度噪声③基线平直度④光谱带宽⑤试样来源⑥试样制备⑦比色皿  

    光度重复性:多次测量(一般是3次)最大值与最小值之间的差值。   

    影响光度重复性的主要因素:  

    ①光源系统(氘灯、钨灯)②光电转换器系统③电源系统④环境  

    杂散光:不同于测试所需要的波长的光叫做杂散光。  

    影响杂散光的主要因素:  

  ①灰尘沾污光学元件②隔板边缘的反射③光学系统屏蔽不好④狭缝的缺陷⑤光束孔径不匹配⑥光学系统的像差⑦单色器内壁黑化处理不当等等  

杂散光对分析测试结果的误差影响是随着吸光度值增大而增大的,会使结果偏离比耳定律。

·杂散光被试样吸收时,偏离是正值。  

    ·杂散光不被试样吸收时,偏离是负值。   

稳定性:稳定性包括基线漂移和光度重复性。      

基线漂移是指冷态开机预热2小时后调零,试剂和参比比色皿都为空气,在固定波长(500nm)下连续测定吸光度1小时,最大值和最小值之差。  

光度噪声(噪声):  

    噪声是指冷态开机预热0.5小时后调零,试剂和参比比色皿都为空气,在500nm下连续测定吸光度1小时,偏离零点的最大值。  

    基线平直度:  

    基线平直度是指冷态开机预热0.5小时后调零,从长波长向短波长对仪器进行全波长慢速扫描吸光度,偏离零点的最大值。  

吸光度和透过率的关系:透过率和吸光度是一一对应的关系,关系式如下:  

A=2 – lgT%  

其中A为吸光度  

    T为透过率  

    若T=100%A = 2 - lg100 = 2 - 2 = 0  

    若T=10%  A = 2 - lg10   = 2 - 1 = 1  

光度分析:固定波长下测定样品的吸光度和透过率。  

定量分析:通过对已知浓度的样品进行吸光度的测定,制作标准曲线,得出曲线的线性方程C=KA+b。再测定未知样品的吸光度,通过线性方程求出样品的浓度。  

动力学测试:固定波长下,测定样品在一段时间内吸光度或透过率的变化图谱,可计算样品的反应率△A/t

    需设定的参数:  

    扫描时间,最多9小时;  

    采样间隔,最小为0.5秒;  

    延时时间  

    扫描波长  

全波长扫描:在仪器波长范围内,设定任意波长区间,对未知试样进行吸光度、透过率的图谱扫描。

     需设定的参数:  

     扫描波长范围  

     扫描间隔,0.10.20.5125nm;  

     扫描速度,建议为低速;  

     T/A模式  

图谱处理  

     图谱放大、缩小、峰谷检测、平滑等处理;  

     图谱存储和调用;  

     使用PC版软件可进行1-4阶求导、四则运算、叠加等分析。 

多波长测试:对某一待测物质在多个波长点进行吸光度、透过率测试。 

    单机版可测试10个波长点;  

    PC版可测试32个波长点。 

DNA/蛋白质测试  

    测试波长缺省值为260280320nm,可修改。  

    可计算DNAProtein的浓度和Ratio。  

单光束分光光度计特点:结构简单、价格便宜  

杂散光、光度噪声、光谱带宽等主要技术指标差,不适合用于技术要求较高的行业,如制药、科研、质量检验行业。  

准双光束分光光度计特点:结构较简单、价格较便宜。  

有一束作为参考光束,能部分抵消光源振动、电子学噪声,以提高仪器的稳定性。  

只有一个比色皿,不能抵消杂散光。 

双光束双转换器分光光度计特点:能部分抵消光源波动、杂散光、电噪声的影响,光度准确好;  

结构较复杂、价格昂贵;  

因一束光分为两束,每束光的能量低,信噪比不如单光束光度计好;  

两个转换器不能完全匹配,故扫描测量误差大,不建议用来做光谱扫描。 

双光束单检测器分光光度计特点:能部分抵消光源波动、杂散光、电噪声的影响,光度准确好、技术指标很先进;  

结构较复杂、价格昂贵;  

因一束光分为两束,每束光的能量低,信噪比不如单光束光度计好。但两束光路对噪声可相互抵消,灵敏度仍然很好。  

四、分光光度计的评价和挑选: 

    适用性、可靠性、智能型、经济性、美学性、工艺性  

适用性:适用性—满足使用要求的程度,主要由技术指标所决定。  

波长准确度:  

对于一般的定量分析,波长准确度不是很重要;  

对不同试样进行比对测试时,波长准确度就相当重要。  

杂散光:  

      在分析的试样较多,浓度较大时很重要。  

杂散光一定时,分析测试的数据会随着浓度的增大,偏离比耳定律的程度就越大,故对待测试样的浓度上限有严格要求;  

分析品种较多的食品、农业等领域,必须挑选杂散光小的仪器。  

光度噪声:  

      分析测试误差的主要来源,且限制被分析试样浓度的下限。  

光度噪声一定时,浓度越低,分析测试的数据的误差就越大,故对待测试样的浓度下限限制较大;  

生化、海洋研究等领域,必须挑选光度噪声小的仪器。  

光谱带宽  

一般常规的在可见光区的分析工作,带宽一般选择4nm;  

用于制药行业的药检,光谱带宽在2nm或以下;  

科研工作建议选择可调带宽的仪器。  

可靠性:从狭义上讲,可靠性就是仪器的故障率。  

从广义上讲,可靠性应从分光光度计的制造和使用两个方面衡量,包括光度准确度、稳定性、故障率及售后服务等内容。  

影响可靠性的因素:首先要查看自己对仪器条件(如光谱带宽、扫描速度、采样间隔、标尺设定等)的选择是否恰当,是否对仪器进行了调零、基线校正、暗电流校正等;  

要严格检查影响仪器光度准确度的主要指标:杂散光、光学元件(尤其是旧机器)、光度噪声、基线平直度;  

检查比色皿是否被污染;  

查看周围有无干扰源,主要是电和磁的干扰;  

检查试样制备的过程;  

检查试样是否过期等等。

转自 http://www.zhyico.com/news_jsview.asp?id=1350

如何选择紫外/可见分光光度计

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原文地址:http://www.cnblogs.com/zhyico2015/p/4346793.html

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